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胃癌是起源于胃黏膜上皮细胞的恶性肿瘤,流行病学调查显示,在全球范围内其发病率位列第5,死亡率位列第4,对患者的身体健康和生命安全带来严重的威胁[1]。胃癌患者常出现胃灼热、反酸和其他常见慢性肠胃道疾病相似症状,在早期难以察觉。尽管近年来胃癌的研究和治疗手段取得了重要的进展,但是胃癌的致病机制尚未十分明确,晚期患者的5年总体生存率低,对胃癌患者进行有效的治疗仍面临着严峻的挑战[2]。因此,研发新的药物有助于优化胃癌的治疗方案。
近年来,随着高通量测序技术的快速发展以及生物数据和医学数据的飞跃式增长,药物重定位已逐渐成为一种发现现有药物新适应症的高效策略,可以加快新药研发的进程。其中基于计算的药物重定位方法通过系统识别潜在的药物−靶点和药物−疾病之间的相互作用,可大大降低传统药物研发的成本、周期和风险[3]。关联图谱(connectivity map, CMap)数据库存储了不同浓度和时间点对癌症细胞系进行小分子药物处理后获得的基因表达谱数据,为探索由小分子化合物引发的基因表达变化特征,揭示小分子化合物、基因以及疾病状态之间的联系提供了重要的研究平台[4]。目前,基于CMap的计算药物重定位方法已被生物学家及医药工作者广泛应用于癌症治疗药物的筛选和研发。
本研究利用基于CMap的药物重定位策略筛选治疗胃癌的小分子化合物并预测其靶点。首先,利用GEO数据库中胃癌肿瘤组织和正常对照组织的基因表达谱数据,确定与胃癌发生密切相关的差异表达基因,并基于CMap数据库筛选治疗胃癌的候选药物。然后,利用蛋白质−蛋白质相互作用网络(protein-protein interaction network, PPIN)鉴定关键的枢纽基因,并利用分子对接预测候选药物与枢纽基因的结合能力来预测药物的靶点;进一步,利用生物信息学方法对潜在靶点的表达模式、诊断和预后性能进行分析。
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使用“Limma”R软件包分别对3个数据集GSE54129、GSE26899和GSE65801中肿瘤组织和正常对照组织样本间差异表达的基因进行鉴定。结果显示,以|log2(fold change)|≥1和校正后的P<0.05为筛选标准,在GSE54129、GSE26899和GSE65801数据集中分别鉴定了2 533、521和2 403个差异表达基因(图1a~图1c)。值得注意的是,76个上调基因和127个下调基因在3个数据集中均显著差异表达(图1d~图1e),表明这些基因在胃癌致病过程中可能发挥着重要的作用。
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为了进一步研究上述3个胃癌数据集中重叠差异表达基因的功能,使用“clusterProfiler”R包分别进行了GO功能富集分析和KEGG代谢通路富集分析。如图2a所示,重叠的差异表达基因在细胞外基质组织(extracellular matrix organization)、组织稳态(tissue homeostasis)和激素代谢过程(hormone metabolic process)等生物过程条目显著富集,在含胶原蛋白的胞外基质(collagen-containing extracellular matrix)和内质网腔(endoplasmic reticulum lumen)等细胞组分条目显著富集,在细胞外基质结构成分(extracellular matrix structural constituent)、氧化还原酶活性(oxidoreductase activity)等分子功能条目显著富集。KEGG结果也显示重叠的差异表达基因在蛋白质的消化吸收(Protein digestion and absorption)、药物代谢−细胞色素P450通路(Drug metabolism-cytochrome P450)和细胞外基质−受体相互作用(ECM-receptor interaction)等与胃癌的发生和发展密切相关的代谢通路显著富集,如图2b所示。
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为了探索治疗胃癌的候选小分子药物,本研究采用CMap在线分析工具对胃癌相关基因表达特征与小分子药物之间的联系进行了分析。具体地,通过将重叠的76个上调基因和127个下调基因上传到CMap数据库,以连接分数<−80分为标准,鉴定了10种治疗胃癌的候选药物,如表1所示。
其中,PD-0325901、菲达替尼(fedratinib,TG-101348)、NVP-AUY922、西地尼布和布雷非德菌素A(brefeldin A)为已报道的具有胃癌治疗价值的小分子药物,表明本实验的结果具有可靠性。另外,左炔诺孕酮、TWS-119、Tyrphostin-AG-1478、VU-0415374-1和L-690488为本研究新发现的治疗胃癌的候选小分子化合物。
表 1 利用CMap数据库鉴定的治疗胃癌的候选小分子化合物
序号 药物名 连接分数 作用机制 1 PD-0325901 −95.31 MEK抑制剂 2 Levonorgestrel −92.58 雌激素受体激动剂 3 TWS-119 −92.55 糖原合成酶激酶抑制剂 4 Tyrphostin-AG-1478 −91.22 EGFR抑制剂 5 TG-101348 −87.39 FLT3抑制剂,JAK抑制剂 6 VU-0415374-1 −86.39 谷氨酸受体调节剂 7 L-690488 −84.25 肌醇单磷酸酶抑制剂 8 NVP-AUY922 −82.84 HSP抑制剂 9 Cediranib −82.63 KIT抑制剂,VEGFR抑制剂 10 Brefeldin A −80.46 蛋白质合成抑制剂 -
蛋白质间的相互作用是细胞内蛋白质执行生命功能的重要方式,在包括癌症发生发展等多种生命活动中发挥着至关重要的作用。本研究利用STRING数据库,对在上述3个数据集中鉴定的203个差异表达基因进行相互作用分析,构建了由152个节点和480条边组成的PPIN,如图3a所示。鉴于PPIN中枢纽基因具有成为药物靶点的潜力,利用Cytoscape软件对构建的PPI网络进行可视化和拓扑性质分析,以度(degree)值排名前10%为筛选标准,鉴定了16个枢纽基因,如图3b所示。其中,TIMP1为基质金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase, TIMP)家族重要的成员之一,在抑制基质金属蛋白酶和细胞信号通路(如细胞死亡、增殖和血管生成)等方面具有重要作用[15];PDGFRB是血小板衍生生长因子受体(platelet-derived growth factor receptor, PDGFR),在抑制血管生成和肿瘤细胞增殖过程中起关键作用[16]。而且,TIMP1和PDGFR均可作为胃癌预后生物标志物[16-17],提示枢纽基因在胃癌发病过程中可能发挥着关键作用。
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为了预测胃癌候选小分子药物的靶点,本研究利用Autodock软件对PPIN中枢纽基因编码蛋白质与基于CMap数据库鉴定的候选药物进行了分子对接分析。结果显示,左炔诺孕酮和西地尼布可分别与TIMP1和PDGFRB结合。具体地,西地尼布可与PDGFRB蛋白的口袋结合,结合位点分别为第63位和第112位谷氨酸(GLU),结合能为−6.28 kcal/mol,如图4a所示,这与文献[18]报道的西地尼布能够结合PDGFR家族成员相符合;左炔诺孕酮与TIMP1第100位的丝氨酸(SER)、第102位的缬氨酸(VAL)、第112位的谷氨酰胺(GLN)和第162位的精氨酸(ARG)作用,结合能为−9.24 kcal/mol,如图4b所示。因此,本研究新鉴定的胃癌候选药物左炔诺孕酮可能通过结合TIMP1的口袋,达到治疗胃癌的效果。
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首先,为了验证候选药物潜在靶点基因在肿瘤组织和正常对照组织中的表达模式,通过箱线图展示了TIMP1和PDGFRB在GSE54129、GSE26899和GSE65801 这3个数据集中的表达模式,并利用GEPIA2在线分析工具[19]对药物潜在靶点TIMP1和PDGFRB在TCGA数据库中的表达水平进行了分析。如图5a~5b所示,靶点基因TIMP1和PDGFRB在胃癌肿瘤组织中的表达水平均显著上调(P<0.05)。然后,通过ROC曲线分析评估TIMP1和PDGFRB来区分胃癌患者和正常对照的敏感性和特异性,AUC值越高则代表区分能力越强。如图5c所示,在GSE54129、GSE26899和GSE65801数据集中,TIMP1的AUC值在0.960~0.994之间,基因PDGFRB的AUC值在0.786~0.974之间,表明TIMP1和PDGFRB对胃癌具有较好的诊断效果。进一步,利用Kaplan-Meier Plotter工具进行生存分析来研究TIMP1和PDGFRB分别与胃癌患者总体生存时间的相关性。结果显示,与TIMP1低表达组相比,TIMP1高表达组患者的总体生存率显著降低(P<0.05);类似地,PDGFRB高表达组患者的总体生存率也显著低于PDGFRB低表达组患者的总体生存率(P<0.05),如图5d所示,表明靶点基因TIMP1和PDGFRB的表达水平与胃癌患者的预后生存时间密切相关。
Exploration of Therapeutic Drugs for Gastric Cancer Using Drug Repositioning Strategy
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摘要: 利用药物重定位和生物信息学的方法预测治疗胃癌的候选小分子药物及其潜在靶点,为胃癌的治疗提供新的思路。首先在胃癌数据集GSE54129、GSE26899和GSE65801中鉴定了203个差异表达基因,并利用关联图谱(connectivity map, CMap)分析筛选得到10种候选的小分子化合物。然后,通过对差异表达基因组成的蛋白质−蛋白质相互作用网络进行拓扑性质分析,鉴定TIMP1、PDGFRB、COL1A1等为枢纽基因。进一步,分子对接的结果显示,新鉴定的小分子药物左炔诺孕酮(levonorgestrel)与TIMP1具有较强的结合能力,结合能为−9.24 kcal/mol;已报道的胃癌药物西地尼布(cediranib)与靶点PDGFRB的结合能为−6.28 kcal/mol。另外,潜在靶点基因TIMP1和PDGFRB的表达模式、诊断和预后价值在胃癌数据集中得到了验证。Abstract: This study aims to predict candidate small-molecule drugs for the treatment of Gastric Cancer (GC) and identify their potential targets by using drug repositioning and bioinformatics methods, providing new ideas for GC therapy. In this study, 203 differentially expressed genes were first identified in GC datasets GSE54129, GSE26899 and GSE65801, and 10 candidate small-molecule compounds were screened by the Connectivity Map (CMap) analysis. Then, the topological properties of the protein-protein interaction network composed of differentially expressed genes were analyzed, and TIMP1, PDGFRB, COL1A1, etc. were identified as hub genes. Furthermore, molecular docking results showed that the newly identified small-molecule drug levonorgestrel had strong binding ability with TIMP1, and its binding energy was −9.24 kcal/mol; the binding energy of the reported GC drug Cediranib to the target PDGFRB was −6.28 kcal/mol. In addition, the expression patterns, diagnostic value and prognostic value of the potential target genes TIMP1 and PDGFRB were validated in the GC datasets.
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Key words:
- connectivity map /
- drug repositioning /
- gastric cancer /
- levonorgestrel /
- PDGFRB /
- TIMP1
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表 1 利用CMap数据库鉴定的治疗胃癌的候选小分子化合物
序号 药物名 连接分数 作用机制 1 PD-0325901 −95.31 MEK抑制剂 2 Levonorgestrel −92.58 雌激素受体激动剂 3 TWS-119 −92.55 糖原合成酶激酶抑制剂 4 Tyrphostin-AG-1478 −91.22 EGFR抑制剂 5 TG-101348 −87.39 FLT3抑制剂,JAK抑制剂 6 VU-0415374-1 −86.39 谷氨酸受体调节剂 7 L-690488 −84.25 肌醇单磷酸酶抑制剂 8 NVP-AUY922 −82.84 HSP抑制剂 9 Cediranib −82.63 KIT抑制剂,VEGFR抑制剂 10 Brefeldin A −80.46 蛋白质合成抑制剂 -
[1] SUNG H, FERLAY J, SIEGEL R L, et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA: A Cancer Journal for Clinicians, 2021, 71(3): 209-249. doi: 10.3322/caac.21660 [2] SEXTON R E, AL HALLAK M N, DIAB M, et al. Gastric cancer: A comprehensive review of current and future treatment strategies[J]. Cancer and Metastasis Reviews, 2020, 39: 1179-1203. doi: 10.1007/s10555-020-09925-3 [3] LUO H M, LI M, YANG M Y, et al. Biomedical data and computational models for drug repositioning: A comprehensive review[J]. Briefings in Bioinformatics, 2021, 22(2): 1604-1619. doi: 10.1093/bib/bbz176 [4] LAMB J, CRAWFORD D, PECK D, et al. The connectivity map: Using gene-expression signatures to connect small molecules, genes, and disease[J]. Science, 2006, 313(5795): 1929-1935. doi: 10.1126/science.1132939 [5] RITCHIE M E, PHIPSON B, WU D, et al. Limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies[J]. Nucleic Acids Research, 2015, 43(7): 47. doi: 10.1093/nar/gkv007 [6] WU T Z, HU E Q, XU S B, et al. clusterProfiler 4.0: A universal enrichment tool for interpreting omics data[J]. The Innovation, 2021, 2(3): 100141. doi: 10.1016/j.xinn.2021.100141 [7] SUBRAMANIAN A, NARAYAN R, CORSELLO S M, et al. A next generation connectivity map: L1000 platform and the first 1,000,000 profiles[J]. Cell, 2017, 171(6): 1437-1452. doi: 10.1016/j.cell.2017.10.049 [8] SZKLARCZYK D, GABLE A L, NASTOU K C, et al. The STRING database in 2021: Customizable protein–protein networks, and functional characterization of user-uploaded gene/measurement sets[J]. Nucleic Acids Research, 2021, 49(D1): 605-612. doi: 10.1093/nar/gkaa1074 [9] CLINE M S, SMOOT M, CERAMI E, et al. Integration of biological networks and gene expression data using Cytoscape[J]. Nature Protocols, 2007, 2(10): 2366-2382. doi: 10.1038/nprot.2007.324 [10] MORRIS G M, HUEY R, OLSON A J. Using autodock for ligand-receptor docking[J]. Current Protocols in Bioinformatics, 2008, 24(1): 8-14. [11] ROSE P W, PRLIĆ A, ALTUNKAYA A, et al. The RCSB protein data bank: Integrative view of protein, gene and 3D structural information[J]. Nucleic Acids Research, 2017, 45: 271-281. [12] KIM S, CHEN J, CHENG T J, et al. PubChem 2019 update: Improved access to chemical data[J]. Nucleic Acids Research, 2019, 47(D1): 1102-1109. doi: 10.1093/nar/gky1033 [13] SEELIGER D, GROOT B L. Ligand docking and binding site analysis with PyMOL and Autodock/Vina[J]. Journal of Computer-aided Molecular Design, 2010, 24(5): 417-422. doi: 10.1007/s10822-010-9352-6 [14] LÁNCZKY A, GYŐRFFY B. Web-based survival analysis tool tailored for medical research(KMplot): Development and implementation[J]. Journal of Medical Internet Research, 2021, 23(7): e27633. doi: 10.2196/27633 [15] REED M J, KOIKE T, SADOUN E, et al. Inhibition of TIMP1 enhances angiogenesis in vivo and cell migration in vitro[J]. Microvascular Research, 2003, 65(1): 9-17. doi: 10.1016/S0026-2862(02)00026-2 [16] LIU B H, XIAO X X, LIN Z Q, et al. PDGFRB is a potential prognostic biomarker and correlated with immune infiltrates in gastric cancer[J]. Cancer Biomarkers, 2022, 34(2): 251-264. doi: 10.3233/CBM-210335 [17] WANG C S, WU T L, TSAO K C, et al. Serum TIMP-1 in gastric cancer patients: A potential prognostic biomarker[J]. Annals of Clinical & Laboratory Science, 2006, 36(1): 23-30. [18] BRAVE S R, RATCLIFFE K, WILSON Z, et al. Assessing the activity of cediranib, a VEGFR-2/3 tyrosine kinase inhibitor, against VEGFR-1 and members of the structurally related PDGFR family[J]. Molecular Cancer Therapeutics, 2011, 10(5): 861-873. doi: 10.1158/1535-7163.MCT-10-0976 [19] TANG Z, KANG B, LI C, et al. GEPIA2: An enhanced web server for large-scale expression profiling and interactive analysis[J]. Nucleic Acids Research, 2019, 47(W1): 556-560. doi: 10.1093/nar/gkz430 [20] LEE N V, LIRA M E, PAVLICEK A, et al. A novel SND1-BRAF fusion confers resistance to c-Met inhibitor PF-04217903 in GTL16 cells though MAPK activation[J]. PloS One, 2012, 7(6): e39653. doi: 10.1371/journal.pone.0039653 [21] SATOH T, YAMADA Y, MURO K, et al. Phase I study of cediranib in combination with cisplatin plus fluoropyrimidine (S-1 or capecitabine) in Japanese patients with previously untreated advanced gastric cancer[J]. Cancer Chemotherapy and Pharmacology, 2012, 69: 439-446. doi: 10.1007/s00280-011-1723-8 [22] ENGEMISE S L, WILLETS J M, TAYLOR A H, et al. Changes in glandular and stromal estrogen and progesterone receptor isoform expression in eutopic and ectopic endometrium following treatment with the levonorgestrel-releasing intrauterine system[J]. European Journal of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Biology: An International Journal, 2011, 157(1): 101-106. [23] YUN B H, JEON Y E, SEO S K, et al. Effects of a levonorgestrel-releasing intrauterine system on the expression of steroid receptor coregulators in adenomyosis[J]. Reproductive Sciences, 2015, 22: 1539-1548. doi: 10.1177/1933719115589411 [24] PAKRASHI T, TAYLOR J E, NELSON A, et al. The effect of levonorgestrel on fibrinolytic factors in human endometrial endothelial cells[J]. Reproductive Sciences, 2016, 23(11): 1536-1541. doi: 10.1177/1933719116645193 [25] SOINI T, HURSKAINEN R, GRÉNMAN S, et al. Cancer risk in women using the levonorgestrel-releasing intrauterine system in Finland[J]. Obstetrics & Gynecology, 2014, 124: 292-299. [26] CONZ L, MOTA B S, BAHAMONDES L, et al. Levonorgestrel-releasing intrauterine system and breast cancer risk: A systematic review and meta-analysis[J]. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica, 2020, 99(8): 970-982. doi: 10.1111/aogs.13817